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Der Einsatz von Antibiotikakombinationen, um eine ausreichende in vivo-Aktivität gegenüber einzelnen Antibiotika-resistenten Keimen zu erreichen, ist Gegenstand zahlreicher Studien auf der ganzen Welt. In Zeiten ständig steigender Resistenzraten stellt hier die Behandlung von schweren nosokomialen Infektionen, und insbesondere mit grampositiven Pathogenen wie Methicillin-resistenten Staphylokokken oder multi-resistenten Enterokokken, ein besonderes klinisches Problem dar [1, 2].

Der goldene Standard bei der Therapie von Enterokokken-Infektionen bleibt die synergistisch wirkende Kombination eines Zellwand-aktiven Antibiotikums wie z.B. eines ß-Laktames oder eines Glykopeptides mit einem Aminoglykosid [3]. Unverträglichkeitsreaktionen und die zunehmende Anzahl von multi- und hochresistenten Enterokokkenstämmen unterstreichen allerdings die Wichtigkeit der Suche nach neuen Substan-zen oder Substanzkombinationen mit Anti-Enterokokken-Aktivität.

In dieser Studie wurde die in vitro-Aktivität von Fosfomycin allein und in Kombination bei Vancomycin-empfindlichen und Vancomycin-resistenten klinischen Isolaten von Enterococcus faecalis und Enterococcus faecium bestimmt. Dazu wurde eine neue spektrophotometrische Methode – der Bioscreen-C-Analyzer, der kinetische Bestimmungen erlaubt – verwendet [4]. Zur Evaluierung dieser Methode wurden ebenfalls Bestimmungen mit der Standardmethode – der Checkerboard-Technik – durchgeführt.

Material und Methode

Bakterienstämme und Medien
56 Enterokokkenstämme (41 Vancomycin-empfindliche E. faecalis, sechs Vancomycin-resistente E. faecalis, neun E. faecium) wurden für die Experimente verwendet. Alle Stämme waren klinische Isolate aus Blut, Urin, Sputum oder BAL; als Referenzstamm wurde E. faecalis ATCC 29212 mitgetestet. Als Wachstumsmedium wurde Mueller-Hinton-Bouillon verwendet, für die Fosfomycin-Tests wurde Glucose-6-Phosphat zugegeben.

Antibiotika
Folgende Substanzen wurden getestet: Fosfomycin, Ampicillin, Piperacillin/Tazobactam, Cefpirom, Ceftazidim, Ceftriaxon, Cefipime, Gentamicin, Imipenem, Meropenem, Teicoplanin, Vancomycin und Moxifloxacin. Stammlösungen der Substanzen wurden hergestellt und in flüssigem Stickstoff aufbewahrt. Am Tag des Experimentes wurden die Substanzen aufgetaut und entsprechende Verdünnungen hergestellt.

Minimale Hemmkonzentrationen (MHK)
Die Bestimmung der MHKs erfolgte mittels Bouillon-Mikrodilutionsmethode nach NCCLS-Kriterien [5].

Bestimmung der Aktivität von antibiotischen Kombinationen
Die Aktivität von Kombinationen von Fosfomycin mit Vancomycin, Teicoplanin, Gentamicin, Ampicillin und Moxifloxacin erfolgte nach zwei verschiedenen Methoden:

1) Checkerboard-Technik
Hierbei wurden die sechs Vancomycin-resistenten E. faecalis- und fünf Vancomycin-empfindliche E. faecalis-Stämme getestet. Bakterielle Kulturen wurden in Mueller-Hinton-Bouillon angelegt und in Gegenwart von Antibiotikakombinationen über Nacht bebrütet. Der fractional inhibitory index (FIC) wurde berechnet und wie folgt angegeben:

additiv:

0,5 < FICA + FICB <= 1,0

indifferent:

1,0 < FICA + FICB <= 2,0

synergistisch:

FICA + FICB <= 0,5

antagonistisch:

FICA + FICB > 2,0

2) Bioscreen-C-Analyzer
Diese Methode basiert auf turbidometrischen Messungen von bakteriellen Kulturen während der Inkubation mittels eines automatisierten Gerätes, dem Bioscreen-C-Analyzer. Hierbei werden serielle Verdünnungen von mit verschiedenen Antibiotika-Konzentrationen inkubierten Bakteriensuspensionen hergestellt und nach Inkubation das bakterielle Wachstum kontinuierlich gemessen. Die Ergebnisse werden als Wachstumskurven und als berechnete Werte dargestellt. Unter Einbeziehung der area under the curve (AUC) können folgende Definitionen erstellt werden [1]:

additiv:

AUC(A+B) ± 10% = AUCA x AUCB / AUC0

indifferent:

AUC(A+B) ± 10% = AUCA oder AUCB

synergistisch:

AUC(A+B) + 10% < AUCA x AUCB / AUC0

antagonistisch:

AUC(A+B) – 10% > AUCA oder AUCB

AUC0, AUCA, AUCB, und AUC(A+B) stellen die AUC0-16 Werte dar, die ohne Antibiotikum (AUC0), mit Antibiotikum A (AUCA), Antibiotikum B (AUCB) oder mit den Antibiotika A und B (AUC(A+B)) erzielt wurden.

Ergebnisse

MHK
Die Ergebnisse der MHK-Bestimmungen der getesteten Antibiotika sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Neun Stämme waren Fosfomycin-empfindlich (MHK <= 32 µg/ml), 32 Stämme intermediär-empfindlich (MHK = 64 µg/ml) und neun Stämme resistent (MHK >= 128 µg/ml). In der Gruppe der ß-Laktame zeigte sich Ampicillin als die wirksamste Substanz. Drei Enterokokkenstämme waren multi-resistent, wobei sich jedoch keine Korrelation zwischen Resistenz gegenüber Fosfomycin und den anderen getesteten Antibiotika zeigte.

Aktivität der Antibiotika-Kombinationen
Die Ergebnisse des Bioscreen-C-Analyzers sind in den Tabellen 2 und 3 und den Abbildungen 1 und 2 dargestellt. Alle sechs Substanzen zeigten in Kombination mit Fosfomycin einen additiven oder synergistischen Effekt. Als wirksamste Kombination erwies sich hierbei Fosfomycin und Teicoplanin mit einem synergistischen Effekt bei 44 von 50 Isolaten.

Vergleich von Checkerboard-Technik und Bioscreen-C-Analyzer
Bei 72 Tests wurden 50 übereinstimmende und 22 abweichende Ergebnisse erzielt. Die 22 divergierenden Ergebnisse zeigten im Checkerboard: 19 x additiv (Bioscreen: 10 synergistisch, 9 indifferent), 2 x indifferent (Bioscreen: additiv) und 1 x synergistisch (Bioscreen: additiv). Insgesamt konnte eine gute Korrelation erreicht werden.

Diskussion

Die Ziele dieser Studie waren zweifach: i) die Suche nach der antibiotischen Kombination mit der größten Anti-Enterokokken-Aktivität ii) die Evaluierung des kinetischen Bioscreen-Assays als Routine-Screening-Methode.

Die Bestimmung des FIC mit der Checkerboard-Methode hat Nachteile:
sie ist zeit- und materialaufwändig und liefert keine kinetischen Ergebnisse (Wachstum der bakteriellen Kultur über die Zeit). Damit ist die Grundvoraussetzung für die Anwendung dieser Methode das Vorliegen einer linearen Dosis-Wirkungs-Kurve für jede einzelne Substanz. Im Gegensatz dazu liefert eine spektrophotometrische Methode wie der Bioscreen-Assay eine ständige Aufzeichnung des bakteriellen Wachstums. In einem Ansatz können 200 Proben (mit verschiedenen Antibiotika) gemessen werden. Für diese Studie wurde der Berechung des FIC die AUC0-16 zugrunde gelegt. Damit wurde dem Problem Rechnung getragen, dass durch eine längere Inkubationszeit sowohl die verzögerte antimikrobielle Wirkung von Substanzen wie Ampicillin berücksichtigt wird, als auch eine Unterscheidung zwischen einer lag Phase durch Wachstumsinhibition und dem bakteriellen Killing ermöglicht wird [4].

Es erwies sich der Bioscreen-Assay als durchaus taugliche Methode für das rasche Screening von antibiotischen Kombinationen in der Routine. Der Vergleich mit den Ergebnissen der Checkerboard-Methode zeigte eine gute Korrelation. Divergierende Ergebnisse sind auf unterschiedliche Definitionen der beiden Methoden zurückzuführen (additiv: Summe der Resultate der einzelnen Substanzen im Checkerboard vs. kombinierte Aktivität der einzelnen Substanzen im Bioscreen-Assay).

Einige Autoren beschäftigten sich mit der Interaktion von Fosfomycin mit anderen Zellwand-aktiven Substanzen. Hierbei zeigte sich nur eine geringe Kreuzresistenz zwischen Fosfomycin und anderen Substanzklassen wie ß-Laktamen oder Aminoglykosiden [6, 7, 8]. Ebenso wurden synergistische Effekte von Fosfomycin und ß-Laktamen und Fosfomycin und Daptomycin gegenüber Enterokokken beobachtet. In dieser Studie lagen die MHK50 und MHK90 der getesteten Enterokokkenisolate bei 64 und 128 µg/ml; weiters zeigte sich kein Zusammenhang zwischen Resistenz gegenüber Fosfomycin und Resistenz gegenüber den anderen Substanzen [9, 10]. Als am wirksamsten erwies sich die Kombination von Fosfomycin mit Teicoplanin oder Ampicillin, unabhängig vom Resistenzmuster der einzelnen Stämme [8, 9, 11]. Diese Kombinationen scheinen den Kombinationen von Fosfomycin und Aminoglykosid oder Quinolon deutlich überlegen zu sein. Aus diesem Grunde sollte die Kombination von Fosfomycin mit Teicoplanin oder einem ß-Laktam wie Ampicillin als Therapiealternative bei der Behandlung von schweren Enterokokkeninfektionen in klinischen Prüfungen evaluiert werden.

1. Eliopoulos G.M., Moellering Jr. R.C.: „Antimicrobial combinations.“ In Antibiotics in laboratory medicine, 3rd edn. (Lorian, V., Ed.) The Williams & Wilkins Co., Baltimore, Md. (1992) 432-92.
2. Eliopoulos G.M.: „Increasing problems in the therapy of enterococcal infections.“ European Journal of Clinical Microbiology and Infectious Diseases 12 (1993) 409-12.
3. Pestel M., Martin E., Aucouturier C., Lemeland J.-F., Caron F.: „In vitro interactions between different ß-lactam antibiotics and fosfomycin against bloodstream isolates of enterococci.“ Antimicrobial Agents and Chemotherapy 39 (1995) 2341-4.
4. King T.C., Krogstad D.J.: „Spectrophotometric assessment of dose-response curves for single antimicrobial agents and antimicrobial combinations.“ Journal of (1983).
5. National Committee for Clinical Laboratory Standards. „Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria that Grow Aaerobically – Second Edition: Approved standard M7-A3.“ NCCLS, Villanova, PA (1993).
6. Grossato A., Sartori R., Fontana R.: „Effect of non-ß-lactam antibiotics on penicillin-binding protein synthesis of Enterococcus hirae ATCC 9790.“ Journal of Antimicrobial Chemotherapy 27 (1991) 263-71.
7. Debbia E., Varaldo P.E., Schito G.C.: „In vitro activity of imipenem against enterococci and staphylococci and evidence for high rates of synergism with teicoplanin, fosfomycin and rifampicin.“ Antimicrobial Agents and Chemotherapy 30 (1986) 813-5.
8. Rice L.B., Eliopoulos G.M., Moellering Jr. R.C.: „In vitro synergism between daptomycin and fosfomycin against Enterococcus faecalis isolates with high-level gentamicin resistance.“ Antimicrobial Agents and Chemotherapy 33 (1989) 470-3.
9. Dembry L.M., Farrel P.A., Orcutt D.R., Gerrity L.A., Andriole V.T.: „In vitro activity of trovafloxacin against sensitive and resistant aerobic bacteria using the standard microdilution broth method and the Etest.“ Journal of Antimicrobial Chemotherapy 39, Suppl. B (1997) 35-42.
10. Visalli M.A., Bajaksouzian S., Jacobs M.R., Appelbaum P.C.: „Synergistic activity of trovafloxacin with other agents against gram-positive and -negative organisms.“ Diagnostic Microbiology and Infectious Diseases 30 (1998) 61-4.
11. Greenwood D., Edwards R., Brown J., Ridout P.: „The comparative activity of fosfomycin trometamol against organisms isolated from infected urines.“ Infection 20, Suppl. 4 (1992) 302-4.